注：我們常說的相襯顯微鏡,比較顯微鏡均指相差顯微鏡。相差顯微鏡由P·Zernike（采爾尼克）于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理學(xué)獎。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色透明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時(shí)，波長和振幅變化不大，在明場觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本。相差顯微鏡的基本原理是：把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：1、環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2、相位板（annular phase plate）：在物鏡中加了鍍有特殊膜層（如氟化鎂、硫化鋅與鉻等）的相位板，可將直射光在規(guī)定的區(qū)域內(nèi)通過，且被吸收掉大量的光能量，使直射光的振幅衰減至與衍射光振幅相當(dāng)，同時(shí)改變某一個(gè)位相差，分為兩種：（1）A+相板：將衍射光的相位推遲1/4λ（90°），兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，當(dāng)標(biāo)本折射率大于周圍介質(zhì)時(shí)，標(biāo)本圖像比背景暗，...
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阿貝聚光鏡（Abbe condenser）由德國光學(xué)大學(xué)大師恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）(蔡司公司的創(chuàng)始人之一)設(shè)計(jì)。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于0.60時(shí)，則色差，球差就顯示出來。因此，多用于普通顯微鏡上。傳統(tǒng)顯微鏡的聚光鏡，一般由聚光鏡和光闌組成。聚光鏡支架以齒條、齒輪銜接的導(dǎo)軌連接在顯微鏡鏡臂下端，位于載物臺下方；側(cè)方有調(diào)節(jié)旋鈕可做豎直方向上的升降調(diào)節(jié)；光闌多用調(diào)節(jié)孔徑大小。聚光鏡多由2~3片透鏡組成，前端透鏡即面向物鏡的透鏡上面為平面，這種聚光鏡的NA值（鏡口率）是固定不變的，有些可以更換不同NA值的前透鏡，以與不同NA值物鏡相匹配。
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消色差聚光鏡（Achromatic aplanatic condenser）這種聚光鏡又名“消色差消球差聚光鏡”和“齊明聚光鏡”，它由一系列透鏡組成，它對色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖像，是明場鏡檢中質(zhì)量最高的一種聚光鏡，其NA值達(dá)1.4。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個(gè)視場。
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熒光顯微鏡使用方法和操作規(guī)程：1.用窗簾遮蔽光線，關(guān)閉房間內(nèi)的燈光，除去顯微鏡的防塵罩，確保顯微鏡燈室通風(fēng)良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉(zhuǎn)動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。2.將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。3.打開電源開關(guān)，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的±5%，即可按下啟動開關(guān)點(diǎn)燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動未點(diǎn)燃汞燈，可以多撳動幾次。待超高壓汞燈弧光達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并達(dá)到最大發(fā)光效率，即可開始工作。4.燈泡的調(diào)中：（1）任選一塊標(biāo)本放在載物臺上；（2）轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉(zhuǎn)動濾色片組轉(zhuǎn)換手輪，將紫光(V)或藍(lán)光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉(zhuǎn)入光路，并將10X熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路；（3）調(diào)節(jié)粗微調(diào)手輪，將標(biāo)本像調(diào)焦清晰；（4）前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調(diào)焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉(zhuǎn)動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調(diào)節(jié)視場光欄調(diào)中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至最大；（5）轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調(diào)節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內(nèi)成像清晰；（6）調(diào)整燈箱上的燈泡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中；（7）調(diào)整反光鏡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開；（8）轉(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，...
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Q：熒光顯微鏡燈泡的壽命有多少？A：汞燈使用注意事項(xiàng)：目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸汽形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個(gè)大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。以下來自百度搜索： a.汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時(shí)間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電；b.汞燈在使用過程中，不要隨意開關(guān)汞燈的電源； c.關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自然冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時(shí)，將會造成嚴(yán)重后果！由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強(qiáng)大的電流，輕則燒斷保險(xiǎn)絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件。 d.汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當(dāng)可達(dá)600h，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣品作2-3h的觀察。汞燈價(jià)格昂貴，應(yīng)珍惜使用。e.汞燈壽命終結(jié)的標(biāo)志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。
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1、吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。 2、EB：染色DNA和RNA。 3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD 本身無熒光,無極性，可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后，由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜，因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光，無活力的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4℃下貯存，使用時(shí)取0.22mlFDA貯存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中。使用時(shí)，使最終濃度為0.01%。 4、熒光染料Ho33342和若丹明123：活細(xì)胞雙熒光染色觀察細(xì)胞核和線粒體。一般的生物染料不能穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后改變了細(xì)胞膜的通透性，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但有些活體染料能進(jìn)入活細(xì)胞，并對細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，若丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。采用兩種熒光染料的混合染液可對一個(gè)活細(xì)胞的核和線粒體同時(shí)染色。
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